Effect of the M&G solution infusion in wistar's renal tissue protection submitted to programmed ischemia and reperfusion

Orientador: Ana Terezinha GuillaumonDissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências MédicasResumo: Contexto: A isquemia e reperfusão (I/R) renal está envolvido diretamente e é a principal causa de insuficiência renal aguda, ocorrendo em casos como infarto por embolização ou trombose, quadros de septicemia e transplante renal. Esse processo é complexo, envolvendo respostas imunes inatas e adaptativas, presença de infiltrado celular, produção e liberação de citocinas e quimiocinas, desencadeando respostas celulares e liberação de espécies reativas de oxigênio, além de resultar em apoptose e em alguns casos necrose celular. Nesse contexto, é imprescindível a avaliação dos mecanismos de proteção ao tecido renal. Objetivos: O objetivo foi testar a solução desenvolvida M&G, avaliando sua capacidade protetora no rim. Métodos: Foram selecionados 18 ratos Wistar, divididos em três grupos: Sham, Controle e Estudo. No primeiro, submetido ao processo cirúrgico sem o clampeamento arterial. No grupo controle, foi clampeado a aorta acima e abaixo da artéria renal esquerda, sem a infusão de solução preservadora. No estudo, além do clampeamento, realizou-se a punção da aorta e a infusão contínua da solução M&G por 20 minutos a 15o C. Realizou-se a avaliação morfológica e imunohistoquímica com os marcadores (TNF, IL-8, HIF e VEGF). Resultados: Identificou-se diferenças morfológicas entre os grupos S comparados aos grupos C e E. Na análise dos marcadores, houve redução na intensidade de expressão do TNF e na expressão do VEGF. Conclusão: A solução M&G apresentou redução do processo inflamatório desencadeado pela I/RAbstract: Background: Renal ischemia and reperfusion (I/R) are directly involved with the acute renal failure, occurring in cases such as embolization or thrombosis, septicemia and renal transplantation. This is complex, involving innate and adaptive immune responses, cellular infiltrate, production and release of cytokines and chemokine, triggering cellular responses and release of reactive oxygen species, in addition to resulting in apoptosis and cellular necrosis. In this context, it is essential to evaluate the mechanisms of renal tissue protection. Objectives: The aim of the present study is to analyses the M&G solution developed, testing its protective capacity in the kidney. Methods: we selected 18 Wistar rats, divided into there groups: Sham, Control and Study. In the first one, submitted to the surgical process without the arterial clamping. In the control group, the aorta was clamped above and below the left renal artery, without infusion of a conservative solution. In the study, addition to clamping, aortic puncture and continuous infusion of the M&G solution was infused for 20 minutes at 15o C. Morphological and immunohistochemical evaluation were done with the markers (TNF, IL-8, HIF and VEGF). Results: Morphological differences were identified between groups S compared to groups C and E. In the analysis of the markers, there was a reduction in THF expression intensity and in VEGF expression. Conclusion: The M&G solution presented reduction of the inflammatory porch triggered by I/RMestradoFisiopatologia CirúrgicaMestre em Ciência

Ischemia and reperfusion of the soleus muscle of rats with pentoxifylline

BACKGROUND: Reperfusion of the skeletal muscle worsens existing lesions during ischemia, since the production of reactive oxygen species, associated with intense participation of neutrophils, increases the inflammatory reaction that induces tissue changes. OBJECTIVE: To evaluate the morphological and immunohistochemical changes of the skeletal (soleus) muscle of rats submitted to ischemia and reperfusion with pentoxifylline. METHODS: Sixty rats were submitted to ischemia of the pelvic limb for 6 hours induced by clamping the left common iliac artery. After ischemia, group A animals (n = 30) were observed for 4 hours and group B animals (n = 30) for 24 hours. Six animals constituted the sham group. Pentoxifylline was applied only in the reperfusion period A2 (n = 10) and B2 (n = 10), and in ischemia and reperfusion periods in A3 (n = 10) and B3 (n = 10). The soleus muscle was evaluated by histological (fiber disruption, leukocyte infiltrate, necrosis) and immunohistochemical (apoptosis through caspase-3 expression) analysis. The non-parametric tests Kruskal-Wallis and Mann-Whitney (p < 0.05) were applied. RESULTS: The changes were more intense in group B1, with fiber disruption mean scores of 2.16±0.14; neutrophilic infiltrate of 2.05±0.10; and caspase-3 expression in the perivascular area of 4.30±0.79; and less intense in group A3, with means of 0.76±0.16; 0.92±0.10; 0.67±0,15, respectively (p < 0.05). Caspase-3 was more expressive in group B1 in the perivascular area, with mean of 4.30±0.79 when compared with group B1 in the perinuclear area, with mean of 0.91±0.32 (p < 0.05) CONCLUSIONS: The lesions were more intense when observation time was longer after reperfusion, and pentoxifylline attenuated these lesions, above all when used in the beginning of ischemia and reperfusion phases.CONTEXTO: A reperfusão de músculo esquelético piora as lesões já presentes no período de isquemia, pois a produção de espécies reativas de oxigênio, associadas à intensa participação de neutrófilos, amplia a reação inflamatória que induz alterações teciduais. OBJETIVO: Avaliar as alterações morfológicas e imuno-histoquímicas de músculo esquelético (sóleo) de ratos submetidos a isquemia e reperfusão com pentoxifilina. MÉTODOS: Sessenta ratos foram submetidos a isquemia do membro pélvico, por 6 horas, pelo clampeamento da artéria ilíaca comum esquerda. Após isquemia, os animais do grupo A (n = 30) foram observados por 4 horas, e os do grupo B (n = 30), por 24 horas. Seis animais constituíram o grupo simulado. Administrou-se pentoxifilina apenas no período de reperfusão em A2 (n = 10) e B2 (n = 10) e nos períodos de isquemia e reperfusão em A3 (n = 10) e B3 (n = 10). O músculo sóleo foi avaliado por análise histológica (dissociação de fibras, infiltrado leucocitário, necrose) e imuno-histoquímica (apoptose pela expressão da caspase-3). Foram aplicados os testes não-paramétricos de Kruskal-Wallis e Mann-Whitney (p < 0,05). RESULTADOS: As alterações foram mais intensas no grupo B1, com médias de escore da dissociação de fibras musculares de 2,16 ± 0,14, infiltrado neutrofílico de 2,05 ± 0,10 e expressão da caspase-3 na área perivascular de 4,30 ± 0,79; e menos intensas no grupo A3, com respectivas médias de 0,76 ± 0,16, 0,92 ± 0,10 e 0,67 ± 0,15 (p < 0,05). A caspase-3 mostrou-se mais expressiva no grupo B1 na área perivascular, com média de 4,30 ± 0,79, em comparação com o grupo B1 na área perinuclear, com média de 0,91 ± 0,32 (p < 0,05). CONCLUSÕES: As lesões são mais intensas quando o tempo de observação é maior após a reperfusão, e a pentoxifilina atenua essas lesões, sobretudo quando usada no início das fases de isquemia e de reperfusão.SBACVUniversidade Federal de Mato Grosso do Sul Hospital UniversitárioUniversidade Federal de São Paulo (UNIFESP) Escola Paulista de MedicinaUFMSUNIFESP-EPM Departamento de PatologiaUFMS Departamento de Clínica CirúrgicaUFMS Hospital Universitário Comissão de Residência MédicaUNIFESP, EPM, Depto. de PatologiaSciEL

TNF-alfa e metabolismo do adipócito

Dissertação para obtenção do grau de Mestre no Instituto Superior de Ciências da Saúde Egas MonizA prevalência da obesidade tem vindo a aumentar ao longo dos anos influenciando a qualidade de vida da população, tornando-a mais suscetível ao desenvolvimento de outras patologias como as doenças cardiovasculares e a diabetes. A obesidade é resultante do aumento progressivo do tamanho do tecido adiposo em consequência de maior volume e número de adipócitos, levando a uma crescente síntetese de adipocinas e aumento de células imunitárias que caracteriza a obesidade como uma doença inflamatória crónica. O tecido adiposo deixou de ser considerado apenas como um órgão de armazenamento de lípidos, passando a ser considerado um órgão com função endócrina e desempenhando um papel bastante importante na homeostase do organismo. O tecido adiposo de um indivíduo obeso é caracterizado por um perfil de citocinas pró-inflamatórias como o factor de necrose tumoral-alfa (TNF-α). O TNF-α é uma citocina que possui propriedades pró-inflamatórias, exercendo múltiplas funções biológicas em diferentes tecidos. Em particular, no tecido adiposo, aparenta regular ou interferir no metabolismo do adipócito através de diversos processos. Esta citocina pró-inflamatória tende a desempenhar, entre outros, um papel na redução dos adipócitos. Neste trabalho apresenta-se uma revisão bibliográfica de modo a contribuir para a elucidação dos principais mecanismos associados ao processo inflamatório do tecido adiposo na obesidade, com enfoque particular no TNF-α e no metabolismo do adipócito

Estudo da associação entre a ativação da resposta inflamatória sistêmica na fase aguda do infarto do miocárdio com supradesnivelamento do segmento ST e a zona peri-infarto, definida por ressonância magnética

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas, 2013.Introdução: O aumento da atividade inflamatória sistêmica (AIS) durante o infarto domiocárdio (IM) está diretamente associado à incidência de arritmias ventriculares letais e demorte cardíaca súbita. Do mesmo modo, a extensão da zona peri-infarto (ZPI), caracterizadapor ressonância magnética cardíaca (RMC), está relacionada com a geração de substrato paraas arritmias ventriculares em pacientes que manifestaram IM recente. Nesse contexto, opresente estudo tem como objetivos: 1) avaliar se há associação entre a ZPI e a AIS durante afase aguda do IM; 2) avaliar se o surgimento de obstrução coronariana microvascular,estimado por RMC e coronariografia, é um dos elementos de ligação entre a AIS e a ZPI; e 3)avaliar se há associação entre a extensão da ZPI e o remodelamento ventricular pós IM,constituindo, dessa maneira, um potencial elo causal alternativo para a relação entre ZPI emortalidade.Métodos: Foram incluídos prospectivamente 98 pacientes (55 ± 10 anos) nas primeiras 12horas do IM com supradesnivelamento do segmento ST. Os níveis plasmáticos de proteína Creativa (PCR), interleucina-2 (IL-2) e fator de necrose tumoral α (TNF-α) foram avaliados naadmissão (D1) e no 5o dia (D5) pós-IM. No trigésimo dia após o IM, foi realizada a RMCpara quantificar a ZPI e a massa do infarto.Resultados: Entre o D1 e o D5, os aumentos da PCR (6,0 vs 5,6 vezes, p=0,02), da IL-2 (3,6vs 3,4 vezes, p=0,04) e do TNF-α (3,9 vs 4,6 vezes, p=0,001) foram mais elevados empacientes com ZPI acima do valor mediano (9,98 g) do que nos pacientes com ZPI abaixodesse valor. A PCR, a IL-2 e o TNF-α plasmáticos no D5 e seus respectivos deltas do D1 aoD5 foram positivamente correlacionados com a extensão da ZPI (PCR-D5, r = 0,69, p<0,0001; delta-PCR, r = 0,7, p <0,0001; IL-2-D5, r = 0,5, p <0,0001; delta-IL-2, r = 0,6, p<0,0001; TNF-α, r = 0,5, p <0,0001; delta-TNF-α, r = 0,4, p = 0,0001). Essas correlaçõespermaneceram significantes após ajustes para idade, massa do IM, gênero e o respectivo valordesses mediadores inflamatórios no D1. Não houve associação entre a ZPI e a obstruçãomicrovascular, seja esta estimada pela RMC, seja pela cineangiocoronariografia. Pacientescom ZPI acima da mediana tiveram maior IM e tenderam a apresentar mais remodelamentodo ventrículo esquerdo que os demais (p=0,06).Conclusão: O aumento da AIS durante a fase aguda do IM está diretamente relacionado coma geração de ZPI. Tal associação deve ser considerada entre os potenciais efeitos adversos doaumento excessivo de AIS durante a fase aguda do IM. _________________________________________________________________________________ ABSTRACTIntroduction: Increased systemic inflammatory activity (SIA) during acute phase ofmyocardial infarction (MI) is directly associated with the incidence of lethal ventriculararrhythmias and sudden cardiac death. Similarly, the extension of the peri-infarct zone (PIZ),as characterized by cardiac magnetic resonance imaging (CMRI), is associated with thepresence of substrate for generation of ventricular arrhythmias in patients who recentlymanifested MI. In this context, this study aims to: 1) assess whether there is an associationbetween SIA during the acute phase of MI and the extension of PIZ; 2) assess whether theemergence of coronary microvascular obstruction, estimated by both CMRI and coronaryangiography, is one of connecting elements between the SIA and the PIZ; and 3) whether arelationship exists between the extent of PIZ and the ventricular remodeling after MI, whichmay contribute to the link between PIZ and mortality.Methods: We prospectively included 98 patients (55 ± 10 years) admitted within 12 hours ofMI with ST-segment elevation. Plasma levels of C-reactive protein (CRP), interleukin - 2 (IL-2) and tumor necrosis factor type α (TNF-α) were assessed at admission (D1) and at the fifthday post-MI (D5). Thirty days after MI, CMRI was performed to quantify the PIZ and themass of MI.Results: Between D1 and D5, the relative increases of CRP (6.0 vs. 5.6-fold, p=0.02), IL-2(3.6 vs. 3.4-fold, p=0.04) and TNF-α (3.9 vs. 4.6-fold, p=0.001) were higher in patients withPIZ above the median value (9.98 g) as compared with their counterparts. Plasma CRP, IL-2and TNF-α at D5 and their respective change from D1 to D5 (delta) were positively correlatedwith the extent of PIZ (PCR-D5 r=0.69, p<0.0001; PCR-delta r=0.7, p<0.0001; IL-2-D5,r=0.5, p<0.0001; IL-2-delta, r= 0.6, p<0.0001, TNF-α-D5, r=0.5, p<0.0001; TNF-α-delta,r=0.4, p=0.0001). These correlations remained significant after adjustment for age, gender,MI mass and the respective value of these inflammatory mediators assessed at D1. There wasno association between PIZ and microvascular obstruction. Patients with PIZ above themedian had higher MI extension and tended to have more left ventricular remodeling thantheir counterparts (p=0.06).Conclusion: The raise of the SIA during the acute phase of MI is directly related to thegeneration of PIZ. This association should be considered among the potential adverse effectsof excessive increase of AIS during the acute phase of MI

Estudo do efeito e do mecanismo de ação anti-inflamatória da Esenbeckia leiocarpa Engl. utilizando modelos experimentais in vivo e in vitro

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde. Programa de Pós-Graduação em Farmácia.Introdução: O gênero Esenbeckia (Rutaceae) compreende cerca de 30 espécies, sendo característico de regiões tropicais. A espécie Esenbeckia leiocarpa Engl. é conhecida popularmente no Brasil como guarantã, pau-duro, goiabeira ou guarataia. Espécies pertencentes ao gênero Esenbeckia têm sido utilizadas no tratamento de febre e/ou da malária por indivíduos da região amazônica. Estudos in vitro e in vivo já demonstraram que espécies do gênero Esenbeckia possuem importantes ações farmacológicas, como atividade anticolinesterásica, antimalárica, anti-helmíntica e antimicrobiana. Objetivos: Estudar o efeito e o mecanismo de ação anti-inflamatória do extrato bruto hidroalcoólico (EBH), frações, subfrações e compostos isolados da Esenbeckia leiocarpa Engl. utilizando modelos experimentais in vivo e in vitro. Materiais e Métodos: O efeito do EBH, frações n-hexano (Hex), acetato de etila (AcOEt) ou alcaloide (Alc), subfrações polar (Pol) e apolar (Apol), ou dos compostos di-hidrocorinanteol (DHC) e beta-sitosterol ( -Sit) isolados do EBH foram investigados sobre migração de leucócitos, exsudação, mieloperoxidase (MPO), adenosina-desaminase (ADA), nitrato/nitrito (NOx), interleucina-1 beta (IL-1 ), fator de necrose tumoral-alfa (TNF- ) e proteína inibitória kappa B-alfa (I B- ) na inflamação induzida pela carragenina (Cg) no modelo da bolsa de ar, em camundongos. Ainda, o mecanismo de ação anti-inflamatória exercido pelo EBH, fração Alc e composto DHC foram avaliados sobre a apoptose de neutrófilos humanos, bem como sobre a adesão celular e diferentes funções neutrofílicas, como: fagocitose, degranulação, produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) e citocinas/quimiocinas. Ainda, foi avaliado o efeito do -Sit sobre a captação de cálcio (Ca2+). Resultados: EBH, Alc, Pol, Apol, DHC e -Sit, foram efetivos em inibir a migração de leucócitos, a exsudação e as concentrações de MPO, ADA, NOx, IL-1 e TNF- (P < 0,05). As frações Hex e AcOEt inibiram todos os parâmetros inflamatórios estudados, exceto a exsudação. O composto DHC inibiu a degradação da proteína inibitória I B- . Ainda, EBH, Alc e DHC induziram a apoptose de neutrófilos humanos, quando comparados à apoptose espontânea (AE) (P < 0,05). EBH e Alc, mas não o DHC promoveram aumento significativo, tanto da fagocitose como do processo de adesão celular dos neutrófilos a células A549 (P < 0,05). EBH e Alc promoveram a degranulação, tanto de vesículas secretórias como de grânulos específicos/de gelatinase dos neutrófilos (P < 0,05). EBH, Alc e DHC promoveram também a degranulação de grânulos azurófilos de neutrófilos (P < 0,01). EBH, Alc e DHC inibiram significativamente a produção de EROs, assim como a produção de citocinas/quimiocinas, como interleucina-6 (IL-6), proteína inflamatória de macrófagos-1 alfa (MIP-1 ), proteína inflamatória de macrófagos-1 beta (MIP-1 ) e oncogene-alfa relacionado ao crescimento (GRO- ) por neutrófilos ativados. -Sit promoveu aumento significativo na captação de Ca2+ de forma tempo- e concentração-dependente em neutrófilos ativados, que foi prontamente inibido pela nifedipina, BAPTA-AM, LY294002 e colchicina (P < 0,05). Conclusão: Este estudo demonstrou que a Esenbeckia leiocarpa Engl. possui potente efeito anti-inflamatório. Este efeito parece estar relacionado à inibição da migração de leucócitos, essencialmente de neutrófilos ativados, uma vez que a planta promoveu a degranulação destas células, inibiu as concentrações de enzimas relacionadas à atividade neutrofílica (MPO e ADA), assim como a produção de EROs, aumentou a adesão e a fagocitose, além de induzir a apoptose de neutrófilos. Ainda, o material vegetal inibiu a exsudação, efeito este relacionado também à inibição das concentrações de .NO e de citocinas/quimiocinas de caráter pró-inflamatório: IL-1 , TNF- , IL-6, MIP-1 e MIP-1 e GRO- . O DHC parece ser um dos responsáveis pelo efeito observado, uma vez que também demonstrou efeito anti-inflamatório por meio da inibição da migração de leucócitos, enzimas e citocinas/quimiocinas pró-inflamatórias, além de inibir a ativação do NF- B. Ainda, o -Sit foi efetivo em inibir a resposta inflamatória de forma dependente da captação de Ca2+.Introduction: The genus Esenbeckia (Rutaceae) includes about 30 species, and is characteristic from tropical regions. Esenbeckia leiocarpa Engl. is popularly known in Brazil as "guarantã", "pau-duro", "goiabeira" or "guarataia". Esenbeckia species have been used for treatment of fever and/or malaria by inhabitants of Brazilian amazon region. In vitro and in vivo studies have already demonstrated that Esenbeckia species have important pharmacological actions, such as anticholinesterasic, antimalaric, anthelmintic and antimicrobial activities. Objectives: The aim of this work was to evaluate the effect, as well as the mechanism of anti-inflammatory action of the crude hydroalcoholic extract (CHE), fractions, subfractions, and isolated compounds from Esenbeckia leiocarpa Engl. using in vivo and in vitro models. Materials and Methods: The effect of CHE, fractions n-hexane (Hex), ethyl acetate (AcOEt), and alkaloid (Alk), subfractions polar (Pol) and nonpolar (Nonpol), or isolated compounds dihydrocorynantheol (DHC) and beta-sitosterol (?-Sit) isolated from CHE upon leukocyte migration, exudation, myeloperoxidase (MPO) adenosine-deaminase (ADA), nitrate/nitrite (NOx), interleukin-1 beta (IL-1?), tumour necrosis factor-alpha (TNF-?), and inhibitory kappa-B-alpha protein (I B- ) degradation in the inflammation induced by carrageenan (Cg) in the mouse air pouch model were investigated. Also, the mechanism of anti-inflammatory action of CHE, Alk and DHC on apoptosis of human neutrophil, as well as cell adhesion, and different neutrophil functions, such as: phagocytosis, degranulation, reactive oxygen species (ROS) and cytokines/chemokines production were evaluated. Also, the effect of -Sit on the calcium (Ca2+) uptake was evaluated. Results: The CHE, Alk, Pol, Nonpol, DHC and ?-Sit, inhibited leukocytes, exudation, MPO, ADA, NOx, IL-1?, and TNF-? (P < 0.05). The Hex and AcOEt fractions inhibited all of the proinflammatory parameters, except for the exudation. The compound DHC prevented the I B- degradation. Also, CHE, Alk, and DHC accelerated the spontaneous apoptosis of human neutrophils (P < 0.05). CHE and Alk, but not DHC also increased both the phagocytosis and the adhesion exerted by neutrophils onto A549 cells (P < 0.05). CHE and Alk also promoted the degranulation of secretory vesicles and specific/gelatinase granules (P < 0.05). Also, CHE, Alk and DHC induced the degranulation of azurophilic granules (P < 0.01). Moreover, CHE, Alk and DHC significantly inhibited the ROS production, as well as the production of cytokines/chemokines, such as interleukin-6 (IL-6), macrophage inflammatory protein-1 alpha (MIP-1 ), macrophage inflammatory protein-1 beta (MIP-1 ), and growth-related oncogene-alpha (GRO- ) by activated neutrophils. -Sit promoted a time- and dose-dependent increase of the calcium uptake in activated neutrophils that was promptly reversed by nifedipine, BAPTA-AM, LY294002, and colchicine (P < 0.05). Conclusion: This study showed that Esenbeckia leiocarpa Engl. has a potential anti-inflammatory effect. Such effect seems to be related to the inhibition of leukocyte migration, essentially activated neutrophils, since this herb promoted the degranulation on these cells, and inhibited the concentration of enzymes related to neutrophil activity (MPO and ADA), as well as the ROS production. It also increased both the phagocytosis and adhesion, besides inducing neutrophil apoptosis. Esenbeckia leiocarpa Engl. also inhibited the exudation, in a process related to the inhibition of .NO concentrations, as well as concentrations of proinflammatory cytokines/chemokines: IL-1 , TNF- , IL-6, MIP-1 e MIP-1 e GRO- . DHC seems to be one of the most responsible for this effect, since it also showed an anti-inflammatory effect by inhibiting leukocyte migration, enzymes and pro-inflammatory cytokines/chemokines, besides inhibiting NF- B activation. Also, -Sit was effective in inhibiting the inflammatory response in a Ca2+ uptake-dependent manner

Estudo comparativo entre os efeitos do exercício aeróbico e do anaeróbico no crescimento tumoral e caquexia em ratos com tumor Walker 256 : identificaçao de mediadores participantes neste processo

Orientador: Luiz Cláudio FernandesDissertaçao (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciencias Biológicas, Programa de Pós-Graduaçao em Educaçao Física. Defesa: Curitiba, 2008Inclui bibliografiaÁrea de concentraçao: Exercício e esport

Study of anabolic effect of human parathyroid hormone (1-340 in culture of osteoblasts induced to apoptosis

Orientadores: Silvana Pereira Barros, Decio dos Santos Pinto JuniorTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de PiracicabaResumo: Muitas pesquisas a respeito do paratormônio (PTH) têm demonstrado que o efeito anabólico (neoformativo) desse peptídeo sobre o tecido ósseo, quando administrado de um modo intermitente, resulta na indução de nódulos de mineralização em cultura de osteoblastos, deposição óssea e aumento da resistência a fraturas em todo o esqueleto. Frente a esses possíveis benefícios, o PTH foi aprovado recentemente pela US Food & Drug Administration (FDA) com o nome genérico de Teriparatide e com o nome comercial de Forteo® (Lilly) que já está sendo comercializado para o tratamento da osteoporose, mas, no entanto ainda vem suscitando grande interesse na comunidade científica, uma vez que o seu complexo mecanismo de ação não está totalmente esclarecido. Relatos científicos indicam que parte do anabolismo do PTH se deve a diferenciação e proliferação dos osteoblastos, aumentando significativamente o número destas células, e parte a um efeito inibidor da apoptose nos osteoblastos. O presente estudo investigou in vitro a capacidade anti-apoptótica do hPTH(1-34) em osteoblastos induzidos à apoptose pelo TNF-a, elegendo como modelo de estudo o cultivo de osteoblastos de calvária de rato. As células foram cultivadas em MEM- a, suplementado com SFB, ácido ascórbico, ß-glicerofosfato e gentamicina, e foram divididas em grupos experimentais que receberam tratamentos diferentes. No grupo I, as células foram induzidas à apoptose, recebendo tratamento com o TNF-a; no grupo II, as células não foram induzidas à apoptose e receberam tratamento intermitente com o hPTH(1-34); no grupo III, as células foram induzidas à apoptose e receberam tratamento com o hPTH(1-34); e no grupo IV, as células não foram induzidas à apoptose e não receberam tratamento com o PTH (controle). Para a detecção da apoptose foram empregados os métodos de exclusão por marcação com o corante azul de Trypan (câmara de Neubauer) e a citometria de fluxo (FACSCalibur). Os resultados obtidos foram submetidos à análise estatística que demonstrou que o tratamento intermitente com o PTH inibiu a apoptose em torno de 60% nos osteoblastos induzidos pelo TNF-a, aumentando, desta forma, o número de osteoblastosAbstract: It is still not clear why sustained elevation of parathyroid hormone (PTH) stimulates bone resorption, whereas intermittent administration stimulates bone formation. Intermittent PTH administration was recently approved by the United States Food and Drug Administration as the first form of osteoporosis therapy that increases bone mass de novo, reverses the bone deficit, providing a proof-of-principle that osteoblast-targeted (anabolic) agents can effectively reduce osteoporotic fractures. Considering indications that attenuation of osteoblast apoptosis by daily injections of PTH in mice should account for the increased number of osteoblasts and, thereby, the increased bone formation produced by this treatment regimen, in the present study we aimed to investigate the anti-apoptotic ability of hPTH (1-34) in cultured osteoblastic cells through induction by TNF-a in association with PTH anabolic treatment using a calvariaderived osteoblastic cell line. Cells were cultured in MEM-a, supplemented with FBS, ascorbic acid, ß-glycerphosphate and gentamicin, and were divided in experimental groups that received different treatments. In group I, cells were induced to apoptosis, receiveing treatment with TNF-a; in group II, cells were not induced to apoptosis and received intermittent treatment with hPTH(1-34); in group III, cells were induced to apoptosis and received intermittent treatment with hPTH(1-34); and in group IV, cells were not induced to apoptosis and didn¿t receive intermittent treatment with hPTH(1-34) (control). For determination of cell death, two methods were used: staining with Trypan Blue and flow cytometry. The results were statistically analyzed and demonstrated that intermittent treatment with hPTH(1-34) was able to inhibit apoptosis induction by 60%, thereby increasing osteoblast number even in the presence of TNF-aDoutoradoHistologia e EmbriologiaDoutor em Biologia Buco-Denta

Effects of a Kunitz-type inhibitor (Amblyomin-X) on cell cultures of renal carcinoma

The renal cell carcinoma (RCC) is currently a disease of great clinical interest. Its incidence is increasing, especially the incidental findings, which now represent 50% of new cases diagnosed. Because it is highly resistant to disease chemotherapy and radiotherapy, their potential to cure is the surgical treatment, while in the early stages, organo-confined. Numerous clinical trials have been proposed to treat locally advanced or metastatic tumors, but results are inconsistent in the literature with chemotherapy, immunotherapy, hormone therapy or radiotherapy have shown that clinical research should progress in other directions. It was produced in our laboratory, a recombinant protein originating from a cDNA library of the salivary glands of Amblyomma cajennense called amblyomin-X, capable of inhibiting factor Xa coagulation and induce cytotoxicity in different tumor cell lines. This study evaluated the effects of Amblyomin-X in cultured murine renal cell adenocarcinoma (Renca) and human renal cell carcinoma (Caki-1) at different concentrations (0.15 to 1.5 ƒÝM) of this compound. We analyze the morphology and cell viability, cell cycle and the type of cell death induced by treatment with the protein. It also evaluated the potential of proteasome inhibition of the activity front in dealing with Amblyomin-X. Then determine that the strains Caki-1 and Renca are sensitive to Amblyomin-X, which induces changes in morphology and cell viability after 24 and 48 hours of treatment with Amblyomin-X. We also observed that death was dose-dependent and time-dependent, inducing a decrease in all phases of the cell cycle and decreased levels of IL-6. The results described herein suggest that the Amblyomin-X induces cytotoxicity in Renca cells through the mechanism of apoptosis. One of the possible targets of Amblyomin-X is the ubiquitin-proteasome system, as was also observed inhibition of catalytic activity of the proteasome chymotrypsin type.O carcinoma de células renais (CCR) representa atualmente uma patologia de grande interesse clínico. Sua incidência vem aumentando, especialmente os achados acidentais, que hoje representam 50% dos casos novos diagnosticados (23). Por tratar-se de patologia altamente resistente à quimioterapia e radioterapia, seu potencial de cura encontra-se no tratamento cirúrgico, quando em estádios iniciais, órgano-confinados (62). Inúmeros ensaios clínicos foram propostos para tratar tumores localmente avançados ou metastáticos, mas os resultados inconsistentes encontrados na literatura sejam com quimioterapia, imunoterapia, hormonioterapia ou radioterapia demonstram que a pesquisa clínica deverá progredir em outras direções (22). Foi produzida, em nosso laboratório, uma proteína recombinante oriunda de uma biblioteca de cDNA das glândulas salivares do carrapato Amblyomma cajennense, denominada Amblyomin-X, capaz de inibir o fator Xa de coagulação e de induzir a citotoxicidade em diferentes linhagens de células tumorais (24). Neste trabalho foram avaliados os efeitos do Amblyomin-X em culturas de adenocarcinoma de células renais murinas (Renca) e carcinoma de células renais humanas (Caki-1) com diferentes concentrações deste composto. Analisamos a morfologia e viabilidade celular, ciclo celular e o tipo de morte celular induzido pelo tratamento com a proteína. E também foi avaliado o potencial de inibição da atividade proteassômica frente ao tratamento com Amblyomin-X. Os resultados mostraram que as linhagens Caki-1 e Renca são sensíveis ao Amblyomin-X, o qual induz modificações nas características morfológicas e viabilidade celular após 24 e 48 horas de tratamento. Observamos também que houve morte dose e tempo-dependente, modulação das fases G0/G1 e diminuição das fases S e G2/M do ciclo celular e que em altas concentrações de Amblyomin-X, devido ao seu efeito citotóxico, diminui todas as fases do ciclo celular. Em células Caki-1 ocorreu decréscimo dos níveis de Interleucina-6. Os resultados descritos neste trabalho sugerem que o Amblyomin-X induz citotoxidade em células Renca através do mecanismo de Apoptose. Um dos possíveis alvos do Amblyomin-X é o sistema ubiquitina-proteassomo, visto que foi observada a inibição da atividade catalítica do proteassomo do tipo quimiotripsina em células tratadas com Amblyomin-X.Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)FAPESP: 08/52338-7TEDEBV UNIFESP: Teses e dissertaçõe